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動物組織/細胞RNA提取試劑盒(DNase I)操作步驟
點擊次數(shù):2668 更新時間:2022-05-25

 動物組織/細胞RNA提取試劑盒(DNase I)說明書

RNApure Tissue KitDNase I

動物組織/細胞RNA提取試劑盒(DNase I

目錄號:K0560

保存:DNase I、10×Reaction Buffer-20

       其它組分:室  溫

組分說明

     Cat.No.                         K0560

     KitSize                           50

     DNaseI                         1000U

     10×ReactionBuffer           1000μl

     BufferRL                       35ml

     BufferRW1                     40ml

     BufferRW2concentrate)   11ml

     RNase-FreeWater              10ml

     SpinColumnRM                 50

     CollectionTube1.5ml     50

     CollectionTube2ml     50

產(chǎn)品簡介

     本試劑盒將高效的異硫氰酸胍裂解技術(shù)與硅基質(zhì)膜純化技術(shù)相結(jié)合,可從動物細胞及組織中高效提取總 RNA。起始樣本一般最多 30mg 組織或 1x107   細胞。本試劑盒還可回收未*純化的 RNA、體外轉(zhuǎn)錄和酶促反應(yīng)后得到的 RNA。用本試劑盒可提取純化分子量大于 200 堿基的高品質(zhì) RNA,幾乎無 DNA 殘留。如果要進行對微量 DNA 非常敏感的 RNA 實驗,殘留的 DNA 可利用無 RNase DNase 在柱上進行消化去除。提取的 RNA 可用于 RT-PCRNothernBlot、DotBlot等下游實驗。

注意事項

1.  預(yù)防RNase污染,應(yīng)注意以下幾方面:

    1)使用無RNase的塑料制品和槍頭,避免交叉污染。

    2)玻璃器皿應(yīng)在使用前于180℃高溫下干烤4小時,塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10分鐘,用水*沖洗后高壓滅菌。

    3)配制溶液應(yīng)使用無RNase的水。

    4)操作人員戴一次性口罩和手套,實驗過程中要勤換手套。

2.  提取的樣品避免反復(fù)凍融,否則影響 RNA 提取的量和質(zhì)量。

3.  BufferRL 在使用前請加入β-巰基乙醇,1mlBufferRL 10μl β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的 BufferRL 室溫可保存1 個月。

4.  第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標簽的說明先在 BufferRW2 中加入無水乙醇。

5.  BufferRL 如果產(chǎn)生沉淀,可于 56℃加熱使其溶解后室溫放置。

6.  所有離心步驟均在室溫下進行,且所有操作步驟動作要迅速。

自備試劑:  β-巰基乙醇、無水乙醇(新開封或提取RNA專用)  

操作步驟

1.  樣品處理

    1a. 組織:將組織在液氮中磨碎。每20-30 mg組織加600  μl Buffer RL(使用前檢查是否加入β-巰基乙醇),組織樣本少于20 mg350  μl Buffer RL。樣品體積不超過BufferRL體積的十分之一。

1b 單層培養(yǎng)細胞:將細胞在培養(yǎng)瓶中直接裂解或處理成細胞懸液,離心得到細胞沉淀,棄上清,每6-10 cm 2培養(yǎng)面積加入600  μl Buffer RL,小于6 cm2 加入350  μl Buffer RL,反復(fù)吹打幾次,使其充分裂解。

   1c. 細胞懸液:12,000rpm6(~13,400×g)離心1分鐘棄上清,得到細胞沉淀。每5×106 -1×107 細胞加入600 μl Buffer RL ,少于5×106細胞加入350 μl Buffer RL,反復(fù)吹打幾次,使其充分裂解。

注意:1盡量除盡細胞培養(yǎng)基,細胞培養(yǎng)基可能抑制細胞的裂解影響RNA產(chǎn)量。

2)盡量使細胞充分懸浮并充分裂解,否則影響RNA產(chǎn)量。

2.  樣品充分裂解后,室溫放置5分鐘,使蛋白核酸復(fù)合物*分離。

3.  12000rpm離心2-5min,取上清進行以下操作。

4.  向步驟3中得到的溶液中加入1倍體積(600  μl 350  μl)的70%乙醇(無RNase水配制),混勻。

   注意:加入乙醇后可能會產(chǎn)生沉淀,不會影響后續(xù)實驗。

5.  將上步所得溶液全部加入到吸附柱(SpinColumnRM)中(吸附柱已裝入收集管CollectionTube中),若一次不能將全部溶液加入吸附柱中,請分兩次轉(zhuǎn)入,12,000rpm離心1分鐘,棄廢液。將吸附柱放回收集管中。

    注意:吸附柱的最大載量為100µg,不要超載,否則會影響RNA的產(chǎn)量和純度。

6.  向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1,10,000rpm離心1分鐘,棄廢液,將吸附柱重新放回收集管中。

7.  配制DNaseI 混合液:取52 μl RNase-Free Water,向其中加入8  μl 10×Reaction Buffer 20 μl DNase I1U/μl),混勻,配制成終體積為80 μl的反應(yīng)液。

8.  向吸附柱中直接加入80 µl DNase I  混合液,20-30℃孵育15分鐘。

9.  向吸附柱中加入350  μl Buffer RW110,000rpm離心1分鐘,棄廢液,將吸附柱重新放回收集管中。

10.  向吸附柱中加入500  μl Buffer  RW2(使用前檢查是否加入無水乙醇),12,000rpm離心1分鐘,倒掉收集管中的廢

液,將吸附柱放回收集管中。

11.  重復(fù)步驟10

12.  12,000rpm離心2分鐘,倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘,以*晾干。

   注意:這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除,乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)(酶切、PCR 等)。

13.  將吸附柱轉(zhuǎn)入新的RNase-Free1.5ml 收集管中,向吸附膜中間位置加入30-50  μl RNase-Free Water,室溫放置1分鐘,12,000rpm離心1分鐘,收集RNA溶液,-70℃保存RNA,防止降解。

注意:1RNase-FreeWate體積不應(yīng)小于30 μl,體積過小影響回收率。

2)如果要提高RNA的產(chǎn)量,可用30-50 μl新的RNase-FreeWater重復(fù)步驟13。

3)如果要提高RNA濃度,可將得到的溶液重新加入到吸附柱中,重復(fù)步驟13。

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