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ELISA中陰性的顯色和陰性的本底
點擊次數(shù):2157 更新時間:2011-08-16

ELISA中陰性的顯色和陰性的本底

以常用的間接法測抗體和夾心法測抗原為例。陽性標(biāo)本中含有檢測系統(tǒng)中特異的抗體或抗原,作為橋梁聯(lián)結(jié)免疫吸附劑和酶結(jié)合物,使酶結(jié)合物吸附在固相上,無色底物在酶的作用下轉(zhuǎn)變成有色產(chǎn)物,這就是陰性的顯色,顯色的深度與陽性標(biāo)本中待測抗體或抗原的量成正比。陰性標(biāo)本中不含待測的抗體或抗原,酶結(jié)合物不能聯(lián)結(jié)在固相上,故不顯色。但ELISA是一個復(fù)雜的、多步驟的反應(yīng)過程,反應(yīng)各步中酶結(jié)合物都有可能非特異性的吸附在固相載體上,與底物反應(yīng)呈現(xiàn)顏色,這就形成了陰性的本底。酶結(jié)合物在固相上的非特異吸附通常有以下幾條途徑。

(1)       酶結(jié)合物直接吸附在固相載體上。酶結(jié)合物是蛋白質(zhì),可以直接吸附在固相載體表面。但在ELISA這一步驟中選擇了不利于這種吸附的條件,一般說來只要酶結(jié)合物工作濃度適當(dāng)和反應(yīng)后經(jīng)過*洗滌,可以避免這種吸附。

(2)       酶結(jié)合物與固相上包被蛋白質(zhì)成分起反應(yīng)。包被抗原不純時,雜質(zhì)蛋白也會吸附在固相載體上,某些雜質(zhì)可與酶標(biāo)抗體因“錯認(rèn)”而結(jié)合。

(3)       在間接法中,雜抗原還有可能與血清標(biāo)本中的免疫球蛋白特異或非特異地結(jié)合。另外非特異的免疫球蛋白也可吸附在包被的特異抗原上,特別是這種抗原為堿性蛋白質(zhì)時,此時酶標(biāo)記的第二抗體就與吸附的免疫球蛋白反應(yīng)而形成陰性本底。

(4)       在間接法中標(biāo)本中的非特異免疫球蛋白的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過特異性抗體,因此可以直接吸附在固相上,這是形成陰性本底的主要原因。聚苯乙烯對免疫球蛋白有很好的吸附性能,IgM的吸附力大于IgG,聚合IgG的吸附力大于單體的IgG。酶標(biāo)記的抗Ig(二抗)對吸附在載體上的Ig和與固相抗原結(jié)合的特異性Ig有著同樣的親和力,因此在加入標(biāo)本的反應(yīng)中,雖然采取了不利于吸附的條件,但假設(shè)血清標(biāo)本不作適量的稀釋,高濃度的Ig中仍有一些能吸附在固相上,因而產(chǎn)生較高的本底。

(5)       在雙抗體夾心法中,標(biāo)本中如含有類風(fēng)濕因子,也能使陰性血清顯色。類風(fēng)濕因子是作用于多種動物IgG Fc段的自身抗體,多為IgM類,是一種多價抗體。在夾心法檢測中充當(dāng)抗原成分,同時在固相抗體及酶標(biāo)抗體反應(yīng),使酶標(biāo)抗體結(jié)合到載體上。

(6)       ELISA中引入生物素-親和素系統(tǒng)可以提高檢測的靈敏度,但如果使用不當(dāng),可使本底加深,反而得不償失。生物素標(biāo)記蛋白質(zhì)如比例不合適,極易形成較高的陰性本底。從蛋清中提取的親和素是一種堿性糖蛋白,可以通過靜電作用吸附在聚苯乙烯上,也是造成BA-ELISA高本底的因素之一。從鏈球菌中提取的親和素改善了這一非特異吸附現(xiàn)象。

 

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