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山羊痘病毒(GTPV)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)
點擊次數(shù):341 更新時間:2024-08-07

山羊痘病毒(GTPV)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)

 

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱:山羊痘病毒(GTPV)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)

 

【包裝規(guī)格】50T/盒

 

                                                                    

【預期用途】

本試劑盒適用于檢測羊皮膚和呼吸道等樣本中的山羊痘病毒,適用于山羊痘病毒病感染的輔助診斷,其檢測結(jié)果僅供參考。

 

【檢驗原理】

本試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術,設計一對山羊痘病毒特異性引物,各結(jié)合一條特異性探針,用熒光PCR技術對山羊痘病毒的核酸進行體外擴增檢測,用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。

 

【試劑組成】

     

  規(guī)      

GTPV酶液

       25μL×1管

GTPV反應液

      975uL×1管

GTPV陽性質(zhì)控品

      50μL ×1管

陰性質(zhì)控品

     50μL ×1管

說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

 

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、運輸、反復凍融少于7次,有效期12個月。

 

適用儀器

ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。

 

【標本采集】

    采集疑似患病羊的皮膚組織樣本或呼吸道樣本。

 

【保存和運輸】

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過6個月,標本運送應采用2~8℃冰袋運輸,嚴禁反復凍融。

 

使用方法

1. 樣品處理(樣本處理區(qū))

1.1 樣本前處理

組織樣品:每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1g,手術剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨,加入1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中,8000rpm離心2min,取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中;分泌液樣品直接取100μL于1.5mL滅菌離心管中。

 

1.2  DNA提取

為了使實驗結(jié)果穩(wěn)定、有效、可靠,我們建議使用商品化的病毒DNA 提取試劑盒進行提取,嚴格按照對應試劑盒說明書進行操作。

 

2. 試劑配制(試劑準備區(qū))

根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設所需要的PCR反應管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照;樣品每滿7份,多配制1份),每測試反應體系配制如下表:

試劑

GTPV反應液

酶液

用量(樣本數(shù)為N)

19.5μL

0.5μL

 

3. 加樣(樣本處理區(qū))

將步驟1提取的DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取5μL,分別加入相應的反應管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。

 

4. PCR擴增(核酸擴增區(qū))

4.1 將待檢測反應管置于熒光定量PCR儀反應槽內(nèi);

4.2 設置好通道、樣品信息,反應體系設置為25μL;

熒光通道選擇:檢測通道(Reporter Dye)FAM,淬滅通道(Quencher Dye)NONE,請勿選擇ROX參比熒光

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設置:

步驟

循環(huán)數(shù)

溫度

時間

收集熒光信號

1

1 cycle

95℃

3min

2

40 cycles

95℃

15sec

55℃

30sec

 

 

5. 結(jié)果分析判定

5.1 結(jié)果分析條件設定

設置Baseline和Threshold:一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析,當曲線出現(xiàn)整體傾斜時,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結(jié)果。

 

5.2 結(jié)果判斷

陽性:檢測通道Ct值≤35.0,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。

可疑:檢測通道35<Ct值<38.0,且出現(xiàn)典型擴增曲線的樣本建議重復試驗,重復試驗結(jié)果出現(xiàn)Ct值≤38.0和典型擴增曲線者判為陽性,否則為陰性。

陰性:樣本檢測結(jié)果無Ct值且無明顯的擴增曲線。

 

6. 檢測方法的局限性

樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關;

樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現(xiàn)假陽性結(jié)果;

陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏,會導致假陽性結(jié)果;

病原體在流行過程中基因突變、重組,會導致假陰性結(jié)果;

不同的提取方法存在提取效率差異,會導致假陰性結(jié)果;

試劑運輸,保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果;

本檢測結(jié)果僅供參考,如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

 

7. 質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品:無明顯擴增曲線且無Ct值顯示;

陽性質(zhì)控品:擴增曲線有明顯指數(shù)生長期,且Ct值≤30;

以上條件應同時滿足,否則實驗視為無效。

 

8. 性能指標

1)敏感性:內(nèi)控樣本敏感性為100%,綜合評價敏感性98%以上。最低檢測限不低于1000copies/ml。

2)特異性:100%。

3)穩(wěn)定性:批內(nèi)及批間差異≤3%。

 

注意事項

所有操作嚴格按照說明書進行;

試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化,完全混勻并短暫離心;

反應液應避光保存;

反應中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服;

樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行,以免交叉污染;

實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;

試劑盒里所有物品應視為污染物對待,并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。

2011年開始我們致力于在生命科學領域、生物醫(yī)學實驗技術及論文潤色服務,協(xié)助客戶各類實驗服務及論文潤色十余年,是客戶您值得信賴的科研合作伙伴!

如果您受時間、試驗條件等限制而無法完成您的課題研究,歡迎您與我們聯(lián)系。

 

實驗技術服務:

 


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