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考馬斯亮藍(lán)法測蛋白含量測定試劑盒說明書

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考馬斯亮藍(lán)法測蛋白含量測定試劑盒說明書

可見分光光度法

注意:正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定,

確保蛋白濃度在0~1000µg/ml范圍內(nèi)。

測定意義

樣品可溶性蛋白質(zhì)含量常常用于酶活性計(jì)算。此外,可溶性蛋白質(zhì)含量也用于食品等質(zhì)量分析。

測定原理

在酸性溶液中,考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合形成藍(lán)色復(fù)合物;該復(fù)合物在595nm處有大吸收峰, 其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。該方法靈敏度高,適合微量蛋白質(zhì)分析。

自備儀器和用品

離心機(jī)、可見分光光度計(jì)、移液器、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制

試劑一:液體×1 瓶,4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品:液體×1 瓶,4℃保存。

樣品中可溶性蛋白質(zhì)提取

1. 液體樣品:澄清無色液體樣品可以直接測定。

2. 組織樣品:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10的比例(建議稱取約 0.1g組織,加入1mL提取液(自備,根據(jù)需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水)冰浴勻漿,8000g,4℃離心10min,取上清,即待測液。(動物樣品常常需要稀釋)

3. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間 3min);然后 8000g,4℃,離心 10min,取上清置于冰上待測。

測定操作:

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min,蒸餾水調(diào)零。

2. 空白管:取1mL玻璃比色皿,加入200μL蒸餾水,1000μL試劑一,混勻后室溫靜置10min,

于595nm比色,10~20min 完成比色,記為A空白管。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管:取1mL玻璃比色皿,加入200μL標(biāo)準(zhǔn)液,1000μL試劑一,混勻后室溫靜置10min,

于595nm比色,10~20min 完成比色,記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

4. 測定管:取1mL玻璃比色皿,加入200μL待測液,1000μL試劑一,混勻后室溫靜置10min,

于595nm比色,10~20min完成比色,記為A測定管。

注意:空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測定一次。

 

 

 

 

計(jì)算公式:

Cpr(µg/mL)= C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)

=50×(A 測定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)

C 標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)品蛋白質(zhì)濃度,50μg/mL。

注意事項(xiàng):

1.加考馬斯亮藍(lán)后,在10~20min 內(nèi)吸光值相對較穩(wěn)定,因此須在10~20min 完成比色。

2.不宜用石英比色皿,可用玻璃或塑料比色皿,測完成后立即用 95%乙醇沖洗。

3.測定前用1~2個樣做預(yù)實(shí)驗(yàn),確保蛋白濃度在0~1000µg/ml 范圍內(nèi),否則需要做相應(yīng)稀釋,使得稀釋后的結(jié)果在 0~1000µg/ml 范圍內(nèi),然后再乘以稀釋倍數(shù)。

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