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一氧化氮 (Nitric oxide ,NO) 含量測定試劑盒說明書微量法

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化氮 (Nitric oxide ,NO) 含量測定試劑盒說明書

量法

:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

定意義:

NO  (Nitric Oxide ,NO) 廣泛分布于生物體內(nèi)神經(jīng)、循環(huán)、呼吸、消化、泌尿生殖等系統(tǒng) 中,特是神經(jīng)組織中較豐富。它作為細胞間及細胞內(nèi)的信息物質(zhì),發(fā)揮信號傳遞的作用,是 種新型的生物信使分子,在機體的生理、病理過程中起著重要的作用。

定原理:

NO在體內(nèi)水溶液中極易氧化生成 NO2-,在酸性條件下,NO2-與重氮鹽磺酸胺生成重氮 化合物,進一步與萘基乙烯基二胺偶合,產(chǎn)物在550nm處有特征吸收峰,測定其吸光值,可 計算NO含量。為了排除樣品色素等的影響,每個樣品需做對照管。

自備實驗用品及儀器:

天平研缽或勻漿器、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96  孔板、蒸餾水。

劑組成和配制:

液:液體 100mL×1  瓶,4℃保存。

試劑一:液體 3mL×1  瓶,4℃避光保存。

二:液體 3mL×1  瓶,4℃保存。

試劑三:液體 6mL×1  瓶,4℃避光保存。

品處理:

1.  組織:按照組織質(zhì)量 (g) :提取液體積(mL)15~ 10的比例 (建議稱取約0. 1g組織,加入 1mL提取液) 進行冰浴勻漿。10000g ,4℃離心 15min ,取上清,置冰上待測。

2.  細菌、真:按照細胞數(shù)量 (104個) :提取液體積 (mL) 為500~ 10001的比例 (建議500 萬細胞1mL提取液) ,冰浴超聲波破碎細胞 (功率300w ,超聲3秒,間隔7秒,總時間 3min ) ;然后10000g ,4℃ ,離心 15min ,取上清置于冰上待測。

3.  體液和培養(yǎng)液等其它液態(tài)樣品:直接測定。

測定步驟和操作表:

、  分光光度計或酶標儀預熱30min 以上,調(diào)節(jié)波長至550nm。

、  操作表


對照管

定管

品 (μL)

100

100

試劑一 (μL)


50

試劑二 (μL)

50


試劑三 (μL)

50

50

勻,4℃室溫靜置 15min ,于微量石英比色皿/96  孔板,對照管調(diào)零,測定 550nm  處吸光 ,記為 A 550  。

NO  含量計算:

a.    用微量石英比色皿測定的計算公式如下


標準曲線歸方程為:y=0.016x-0.0103 R2=0. 9986

、組織樣品

NO含量義:25℃時,每克樣品或每毫克蛋白15min生成moL NO2-,相當于moL NO

(1) 按樣本質(zhì)量計算

NO  含量 (μmoL/g=  (A 550 +0.0103÷0.016×V  反總÷  (V  ÷V  樣總×W×10 -3

= 0. 125×  (A 550 +0.0103÷W

(2) 按樣本蛋白濃度計算

NO  含量 (μmoL/mg prot=  (A 550 +0.0103÷0.016×V  反總÷  (V  ×Cpr×10 -3 = 0. 125×  (A 550 +0.0103÷Cpr

、其他樣品:

NO  定義:25℃時,每升樣品15min生成 moL NO2- ,相當于moL NO NO   (μmoL/L=  (A 550+0.0103÷0.016×V  反總÷V  

= 125×  (A 550+0.0103)

V  反總反應總體積,0.2mLV  樣:反應中樣品體積,0. 1mL;V  樣總:加入提取液體積, 1mL;W:樣品質(zhì)量,g;Cpr:蛋白濃度,mg/mL

b.   96  孔板測定的計算公式如下

標準曲線歸方程為:y= 0.008x-0.0103 R2=0. 9986

、組織樣品

NO含量義:25℃時,每克樣品或每毫克蛋白15min生成 moL NO2-,相當于moL NO (1) 按樣本重量計算

NO  含量 (μmoL/g) =  (A 550 +0.0103÷0.008×V  反總÷  (V  ÷V  樣總×W×10 -3

= 0.25×  (A 550+0.0103÷W

(2) 按樣本蛋白濃度計算

NO  含量 (μmoL/mg prot=  (A 550+0.0103÷0.008×V  反總÷  (V  ×Cpr×10 -3 = 0.25×  (A 550+0.0103÷ Cpr

2 、細胞

NO  含量定義:25℃時,每104個細胞15min  生成 moL NO2- ,相當于moL NO。

NO  含量 (μmol/104cell(A 550+0.0103÷0.008×V反總÷ (V÷V樣總×細胞數(shù)量) ×10 -30.25×  (A 550+0.0103÷細胞數(shù)量 (萬個)

3 、  其他樣品:

NO  含量定義:25℃時,每升樣品 15min  生成 moL NO2- ,相當于moL NO。

NO  含量 (μmoL/L=  (A 550 +0.0103÷0.008× V  反總÷V  = 250×  (A 550 +0.0103)   V  :反應總體積,0.2mLV  樣:反應中樣品體積,0. 1mL;V  樣總:加入提取液體積, 1mL;W:樣品質(zhì)量,g;Cpr:蛋白濃度,mg/mL

意事項:

1.  試劑盒 2-8℃保存。

2.  盡量使用新鮮樣品進行檢測,試劑三有腐蝕性,操作時請做好防護措施。

3.  若檢測出得 OD  值在標準曲線范圍外,請將樣品進行適當?shù)臐饪s或稀釋,并在計算公式 除以濃縮倍數(shù)或者乘以稀釋倍數(shù)。

4.  最DI檢出限為 0.65μmoL/L。

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實驗技術(shù)服務:

 



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